DNA測序的原理和步驟

DNA測序的原理和步驟

DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今 DNA序列分析的主流。
　　ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序 PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。